隱藏在襪子里的微生物秘密

時間:2018-10-19 00:07:28 來源: 點擊量:

人的腳部汗腺多達25萬多個,每天能夠分泌超過500毫升汗液。因為穿著鞋襪,汗液不易揮發,形成了非常適宜微生物生長的溫度、濕度和酸堿度環境,而腳部脫落的皮膚角質層則為微生物提供豐富營養物質,腳部的微生物會因此得以大量滋生繁殖。

人的汗液中除了水分,還有乳酸、尿酸等容易產生異味的物質。大量滋生繁殖的微生物會分解皮膚角質層和汗液中的乳酸、尿素,產生含有各種臭味的代謝產物,腳臭由此產生。

普通人平均每天12小時穿著襪子,可以說是“人體的第二皮膚”。因此,襪子需小,但它的性能好壞卻直接影響到腳部的舒適和人體的健康。為此,科學界和產業界推出了具有抗菌防臭功能的襪子,來解決腳臭問題。

那么,問題來了:

問題一:你知道人的腳部到底有多少微生物嗎?

問題二:你知道人的腳部微生物都是什么類型嗎?

問題三:抗菌防臭襪真的有宣稱的抗菌防臭作用嗎?

為了解答上述三個問題,全國衛生產業企業管理協會抗菌產業分會/中關村抗菌產業聯盟聯合廣州工業微生物檢測中心聯合設計了如下實驗來一一對上述問題進行驗證:

本試驗從超市購買未未經抗菌處理的某品牌普通襪,以及經過抗菌處理且抗菌性能檢測結果符合FZ/T 73023的AAA級標準的某品牌抗菌防臭襪。為防止在染整加工過程中可能附著的化學品對本實驗的影響,如浮離的染料等也可能具有一定的抗菌作用,所有的襪子均用無抗抑菌的洗衣粉在洗衣機內洗滌一次,干燥后備用。

然后從廣州市隨機選取3位男士和3位女士作為志愿者,請他們用一只腳穿著普通襪,另外一只腳穿著抗菌防臭襪。然后在穿著12h、3天(每天正常洗腳,不更換襪子)后將測試襪交回,并描述是否汗腳、是否有臭味等情況。

一、人的腳部微生物總數測定

1.測試

在無菌條件下,剪取每雙測試襪的襪底部位,放入含有400ml 0.03mol/l PBS緩沖液的三角錐形瓶中,用玻璃棒攪拌均勻后,將樣液用0.03mol/l PBS做10倍系列稀釋,選取適宜稀釋度,取100ul涂布于平皿上,置于生化培養箱中,細菌37℃培養24h后計數,真菌28℃培養48h后計數。

2、結果

經過測試,在穿著12h后,抗菌防臭襪上面的細菌總量范圍在<400cfu/雙~2.00×104 cfu/雙,真菌總量范圍在<400cfu/雙~4.00×102 cfu/雙。普通襪上面的細菌總量范圍在2.73×106cfu/雙~6.40×107 cfu/雙,真菌總量范圍在1.2×103cfu/雙~9.24×105 cfu/雙。從測試結果看,真菌的總量遠低于細菌,這是因為真菌生長速度較細菌慢。另外,男士普通襪上的細菌平均總量稍高于女士的總量,而抗菌襪上的數據區別不顯著。

襪子穿著3天后,不管是普通襪還是抗菌防臭襪,其細菌總量和真菌總量都有較大的增長,特別是普通襪的真菌數量,增長可達1萬倍,與細菌菌落的總數相當。抗菌防臭襪的數量雖有增加,但總體比普通襪穿著一天的菌量要少。

 

 

△ 圖1 普通襪和抗菌襪穿著12h、3天的細菌、真菌培養圖片

注:PX1a, PX1b為普通襪穿著12h后細菌培養圖片;KX1a,KX1b為抗菌襪穿著12h后細菌培養片;

PZ1a, PZ1b為普通襪穿著12h后真菌培養圖片;KZ1a,KZ1b為抗菌襪穿著12h后真菌培養圖片;

PX3a, PX3b為普通襪穿著三天后細菌培養圖片;KX3a,KX3b為抗菌襪穿著三天后細菌培養圖片;

PZ3a,PZ3b為普通襪穿著三天后真菌培養圖片;KZ3a,KZ3b為抗菌襪穿著三天后真菌培養圖片。

二、人的腳部微生物類型分析

上述試驗采用的是傳統的平皿純培養方法。但我們發現,這種純培養方式僅能培養出1%易培養微生物,如葡萄球菌。而99%以上微生物因為培養環境不適及優勢菌的抑制作用而無法培養出,限制了人們對于微生物菌群結構全面和深入的了解。

近年來,隨著宏基因組學(metagenomics,指通過直接提取特定環境中全部微生物總DNA,對微生物群的基因總和進行功能基因篩選和測序分析的一種新的應用學科)的興起,人們可以對環境中所有的微生物進行檢測,而不是針對單個微生物進行培養和分離,因此能夠對包括無法培養出的所有微生物進行全面的分析,以揭示更高更復雜層次上的生命規律。

本試驗中采用了宏基因組提取與高通量測序的方法。

1、試驗過程

由于日常生活中大多數人穿著襪子的時間約為12h,而用于高通量測序的菌落總數需在106以上,所以選取穿著普通襪的第4號志愿者(細菌菌落總數為6.40×107)的細菌微生物菌群進行測序與分析鑒定。

1.1 基因組DNA的提取和PCR的擴增:將試驗3.2中的樣液用0.45um的濾膜過濾,備用。采用Powerfecal DNA Isolation Kit(MoBio, 美國)試劑盒,提取濾膜上的微生物的總DNA。提取的總DNA采用New England Biolabs 公司的Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer進行擴增。

1.2文庫構建和上機測序:使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進行文庫構建,構建好的文庫經過Qubit 和Q-PCR定量,合格后使用HiSeq2500 PE250進行上機測序。

1.3生物信息學分析:將測序數據上傳至MR-RAST服務器端。去除低質量的序列后進行數據分析,計算在97%的相似水平上每個樣本的操作分類單元數量,進行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類分析。

2.襪子上細菌總DNA測序結果分析

通過提取普通襪中微生物基因組DNA,對16S rRNA V4區測序,共獲得用于物種分類的OUT 6352 條,涵蓋了11門、26綱、55目、103科、213屬的細菌。

 

△ 圖2 用Krona對注釋結果進行繪圖展示

2.1 門、綱、目水平的優勢菌群分布特征

菌群分類發現,放線菌門(Actinobacteria 29.1%)、變形菌門(Proteobacteria 37.6%)、厚壁菌門(Firmicutes 25.5%)和擬桿菌門(Bacteroidetes 7.2%)是主要的細菌菌門,其相對豐度占群落的99.4%。

 

△ 圖3 樣品中門水平細菌菌落結構及分布

在綱水平上,放線菌門的放線菌綱(Actinobacteria 100%)、變形菌門的α-變形菌綱(Alphaproteobacteria 14.6%)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria 84.8%)、厚壁菌門的芽孢桿菌綱(Bacilli 99.6%)、擬桿菌門的黃桿菌綱(Flavobacteriia 97.2%)和 鞘脂桿菌綱(Sphingobacteriia 1.4%)是主要的優勢菌群。其中,放線菌綱的優勢菌目為棒桿菌目(_Corynebacteriales 68.0%) 和微球菌目(Micrococcales 30.9%),α-變形菌綱的優勢菌目為柄桿菌目(Caulobacterales 34.5%)、紅桿菌目(Rhodobacterales 29.1%)、紅螺菌目(Rhodospirillales 29.1%), γ-變形菌綱的優勢菌目為假單胞菌目(_Pseudomonadales 96.6%),芽孢桿菌綱的優勢菌目為芽孢桿菌目(Bacillales 98.4%),黃桿菌綱的優勢菌目為黃桿菌目(Flavobacteriales 100%)。

 

△ 圖4 樣品中綱水平細菌菌落結構及分布

 

△ 圖5 樣品中目水平細菌菌落結構及分布

2.2 屬水平的優勢菌群分布特征

以屬為分類單元分析樣品的細菌群落結果如圖6所示。普通襪上的細菌覆蓋了213個屬,其中相對豐度大于1%的包括11個屬,分別是葡萄球菌屬 ( Staphylococcus,24.9%)、棒狀桿菌屬( Corynebacterium,19.5%)、水棲菌屬(Enhydrobacter,18.4%)、不動桿菌屬(Acinetobacter,8.8%)、金黃桿菌屬( Chryseobacterium ,6.7%)、微球菌屬(Micrococcus, 6.2%)、假單胞菌屬( Pseudomonas,3.3%)、玫瑰單胞菌屬(Roseomonas, 1.6%),泛生菌屬(Pantoea 1.0%)及未知屬2個(3.1%)。

 

△ 圖6 樣品中屬水平細菌菌落結構及分布

2.3 屬水平優勢菌群分析

葡萄球菌屬(Staphylococcus ,24.9%):是一群革蘭氏陽性球菌,因常堆聚成葡萄串狀,故名。多數為非致病菌,少數可導致疾病。葡萄球菌是最常見的化膿性球菌,是醫院交叉感染的重要來源。

棒狀桿菌屬( Corynebacterium,19.5%):革蘭氏染色陽性桿菌。因其成員的一端或兩端膨大呈棒狀而得名。治病物質主要是外毒素。病菌通常在咽喉部粘膜上生長繁殖并分泌外毒素,可引起局部炎癥,形成灰白色假膜。外毒素入血后引起全身中毒癥狀,常損害心肌與外周神經等。

水棲菌屬(Enhydrobacter,18.4%):極短的直桿菌,外觀似球狀,含有氣泡。單個、成對或出現短鏈。革蘭氏陰性。從葡萄糖和其他碳水化合物代謝產酸。

不動桿菌屬(Acinetobacter,8.8%):生物學特性 革蘭陰性球桿菌,常見成對排列,可單個存在,有時形成絲狀和鏈狀。不動桿菌屬(Acinetobacter)非發酵菌是條件致病菌,當機體抵抗力降低時易引起機體感染,是引起醫院內感染的重要機會致病菌之一。

金黃桿菌屬( Chryseobacterium ,6.7%):該細菌為革蘭氏染色陰性,菌落典型半透明、光滑、全緣或偶爾不透明。菌落在固體培養基上生長物有黃色、橙色、紅色或褐色色素,其色澤隨培養基和溫度而變化。該菌嚴格好氧,培養溫度應低于30℃,否則可抑制生長。黃桿菌可引起肺炎,也可招致腦膜炎、敗血癥等感染。該病的致病力不強,為條件致病菌,一般情況下不引起感染,但在機體免疫力下降時可能引起感染。

微球菌屬(Micrococcus, 6.2%):該菌廣泛存在于自然界。化能異養菌,代謝為嚴格的呼吸型。通常可利用的碳水化合物有丙酸鹽、乙酸鹽乳酸鹽、琥珀酸鹽谷氨酸鹽和碳水化合物。產氣,產少量酸或不產酸。

假單胞菌屬( Pseudomonas,3.3%):專性需氧的革蘭氏染色陰性無芽胞、有莢膜桿菌,呈桿狀或略彎。存在于土壤、淡水、海水中。目前已確認有 29種,其中至少有3種對動物或人類致病。

玫瑰單胞菌屬(Roseomonas, 1.6%):是一種粉紅色的、革蘭氏陰性、需氧的小球桿菌。1993年才對該菌進行分類和正式命名,在《伯杰氏細菌鑒定手冊》第9版上還沒有收錄。該菌多是從一些臨床病人標本中分離獲得,如血、傷口、滲出液、潰瘍等,80%的分離病人多合并一些免疫低下疾病,因此許多學者普遍認為,該菌可能為條件致病菌,臨床上確有因合并該菌感染而致死的病例報道。我國目前還沒有關于這方面臨床病例的報道。近來,一些學者又從飲用水、淡湖水、土壤以及其他一些自然環境樣本中分離到了玫瑰單胞菌。本文是第一次從人體皮膚中報道分離出此菌,且為腳部的優勢菌群,占比1.6%。

泛生菌屬(Pantoea 1.0%):細胞呈直桿狀,以周生鞭毛運動,大多數菌株產生黃色素。兼性厭氧,具有代謝和發酵類型的化能異養菌。最適溫度30℃。 D-葡萄糖和其他糖類可產酸,不產氣。分離自植物表面、種子、土壤和水,也可從動物和人的傷口、血和尿中分離到。是人的條件致病菌。

其他(3.1%):在本研究中,有兩種優勢菌群不能劃到確定的屬,分別隸屬于變形菌門α-變形菌柄桿菌目,柄桿菌科和變形菌門 α-變形菌紅桿菌目, 紅桿菌科。其中可能包含對人畜有致病性的潛在病原菌。

三、抗菌防臭襪性能測定

1、試驗準備

1)測試樣品的準備:按照標準FZ/T 73023將洗滌50次的抗菌防臭襪作為待測樣品,取標準空白布作為空白試樣,分別剪成0.5cm*0.5cm大小的碎片。稱取0.75g多份,121℃滅菌15min,備用。

2)接種菌液的準備:金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接種液的準備:取3-10代細菌菌種,在營養瓊脂培養基上劃線,37℃培養24h后挑取典型菌落,接種至營養肉湯中,37℃振蕩培養18-20h,制成接種菌懸液。白色念珠菌接種液的制備:從3-10代細菌種中取一接種環,劃線至沙氏瓊脂培養基斜面上,培養成熟后用PBS緩沖液洗下菌苔,均勻稀釋備用。

2、試驗操作

準備3個250ml三角錐瓶,一個加入樣品,一個加入空白布樣,一個不加式樣用于陽性對照,在每個燒瓶中加入70ml 0.03mol/L PBS緩沖液,再各加入5ml已準備好的接種菌液。做“0”接觸時間取樣,將空白試樣和測試樣品振蕩培養后取樣,對其進行稀釋涂布計數。

3、結果報告

通過對比空白試樣和抗菌試樣18h后的活菌數并計算抑菌率發現:在洗滌50次后,抗菌防臭襪對三種測試微生物的抗菌率均達到95%以上,其中,大腸桿菌為99.02%,金黃色葡萄球菌為97.66%,白色念珠菌為96.35%。根據FZ/T73023規定,該抗菌防臭襪符合AAA級標準。

 

四、總結

通過本試驗不僅可以發現,人的腳部微生物數量眾多,而且種類也非常豐富,涵蓋了11門、26綱、55目、103科、213屬。在這213屬細菌中,有11種為優勢菌群。值得我們注意的是,這11種優勢菌群中有不少是致病菌,能夠導致腳部糜爛、水皰等。

本試驗同時表明,志愿者們穿著抗菌防臭襪的那只腳的細菌、真菌總數遠低于穿著普通襪的那只腳。且在臭味感官評價中,普通襪在志愿者們穿著12h和3天后,均能聞到難聞的臭味;而抗菌防臭襪在經志愿者們穿著同樣時間后,均沒有聞到異味。這證明,抗菌防臭襪通過效抑制微生物的繁殖來有效的解決了腳部異味的產生。


作者:廣州工業微生物檢測中心 輕工產品檢測事業部 胡海艷博士
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